受福馬林固定和石臘包埋法遮蔽的抗原決定子可以透過酵素消解(enzymatic digestion)、皂素(saponin)或加熱的方式露出。請勿與未經石臘包埋的冷凍切片或細胞一同使用。以下摘錄不同處理方法:

 

Pronase® 蛋白酶 :室溫條件下, 在pH值7.6、含有0.0025% PRONASE® 蛋白酶(Calbiochem Cat. No. 53702)的10 mM Tris 緩衝液中孵育切片。在含有0.2%甘胺酸的PBS溶液中進行清洗以終止消解。

胰蛋白酶: 室溫條件下, 使用PBS溶液和0.1%胰蛋白酶(Calbiochem目錄編號6502)孵育切片。

使用濃度0.1 mg/mL的黃豆胰蛋白酶抑制劑(Soybean Trypsin Inhibitor, Calbiochem目錄編號65035), 在PBS溶液中孵育切片5分鐘。

胃蛋白酶:室溫條件下, 使用pH值2.3、0.01 N的HCl溶液和0.1%的胃蛋白酶(Calbiochem 目錄編號516360)孵育切片。在蒸餾水中反複清洗中止步驟。

皂素: 室溫條件下, 使用蒸餾水調配和0.05%的皂素(Calbiochem目錄編號558255)孵育切片30分鐘。并且在PBS溶液中清洗至少三次。

神經胺酸水解酶: 室溫條件下, 使用PBS溶液和0.02 units/mL的神經胺酸水解酶(Neuraminidase, Calbiochem目錄編號480717)孵育切片60分鐘。在PBS溶液中清洗至少三次。

加熱: 95°C條件下, 使用10 mM檸檬酸鈉(pH 6.0)緩衝液孵育10分鐘。添加初級抗體前讓載玻片冷卻至室溫條件, 并且持續(xù)進行染色步驟。備注: 使用壓力鍋可以得到更好的結果(請參見以下敘述)。

4 N HCl: 37°C條件下使用10 mM檸檬酸鈉(pH 6.0)孵育切片10分鐘。在蒸餾水中清洗至少三次。

福馬林固定和石臘包埋切片的壓力鍋預處理法:

 

在檸檬酸緩衝液中對福法林固定或石臘包埋的組織切片使用壓力鍋進行預熱處理10分鐘, 讓抗原位(antigenic site)得以曝露以及減少背景訊號。

 

*進行步驟4和步驟5時請戴上護目鏡和防熱手套。

 

將載玻片置于含有pH值6.0、200 ml濃度10 mM檸檬酸鹽緩衝液的塑膠染色壺(Coplin jar)中。然后將載玻片移至載具上待測。將染色壺上蓋松開, 讓蒸氣得以從空隙逸散。

將1公升的水加入含有一座矮腳蒸架(steaming rack)的壓力鍋中。然后把壓力鍋放在實驗室加熱板上。把染色壺放入壓力鍋中(最多可同時處理4個染色壺)。上緊壓力鍋的蓋子, 然后把壓力平衡砝碼放在壓力鍋蓋中央的通風口頂部。

將加熱板上的加熱設定調整到最高。約30分鐘后, 壓力鍋蓋上的砝碼會因為蒸氣逸散而滾落。此時將加熱設定調整到中度范圍。計時器設定為10分鐘。

10分鐘過去后, 把加熱板關閉并且小心地將壓力鍋移到耐熱的桌面上。

經過10分鐘的冷卻, 移去砝碼讓蒸氣得以散逸。當安全鎖掉落回原位時, 就可以開啟壓力鍋蓋并將染色壺移出。

移出載玻片并讓它冷卻15分鐘。之后將載玻片移入PBS溶液中5分鐘。

使用標準實驗步驟進行IHC染色。